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高效液相檢驗時重復樣與進針次數

嘉峪檢測網        2019-11-21 16:29

樣品檢驗和方法學驗證時樣品測定個數和進樣針數的選擇,是藥品檢驗領域中分析人員平時經常遇到,并永遠都在糾結的問題。目前,已有優秀的作者結合《中國藥典》2015年版等法規進行了總結(藥物常規檢查項與方法學驗證測定/進樣針數討論,見參考文獻1)。高效液相操作簡單,分析速度快,通用性強,是目前藥企配置的最基本檢驗儀器之一,對高效液相檢驗時重復樣與進針次數討論具有重要的價值。高效液相檢驗的一般目的在于鑒別、有關物質檢查、含量測定這3個主要目的,本文結合實際應用對目前使用最多的高效液相進樣方式進行了簡單的梳理。

一、鑒別

 

 

鑒別試驗,通常藥典在進行含量測定的同時進行鑒別(參考文獻2),而某些鑒別或者說比對,離子交換色譜(如抗體的酸堿峰)、肽圖、異構體、中藥指紋圖譜這些則是半定量或者定性的實驗。對于與含量測定一起進行的鑒別,應按照含量測定的要求,我們在下面介紹。對于半定量或者定性的實驗,其通常的要求是供試品與對照品一致,簡單點講就是標準品1份1針、樣品1份1針。系統適用性在除藥典有要求的情況下進得比較少,通常可用對照品溶液的系統適用性結果來替代。

 

但在日常工作中,高效液相第一針出現異常的情況比較多見。因此即使是需要長時間梯度的肽圖、指紋圖譜等檢驗,每次工作時剛開始檢驗時,至少應加1個平衡色譜柱樣品或者流動相空白樣品,以防止色譜柱未清洗干凈或因為流動相梯度初次變化帶來的色譜圖異常。在藥檢中對異常色譜圖的解釋絕對是件頭疼的事。

 

二、有關物質檢查和含量測定

 

 

有關物質檢查即通常說的雜質鑒定和定量,主要包括加校正因子和不加校正因子的主成分自身對照法以及面積歸一化法、雜質對照品法(外標法)。主成分自身對照法以及面積歸一化法通常可在對主成分定量是同時進行,而雜質對照品法(外標法)則需要每次以雜質對照品溶液進行外標。總體上來說,有關物質檢查和含量測定對重復樣與進針次數通常與含量測定時一致的,可能的區別在于雜質鑒定需要增加峰鑒別溶液(1份,1針)。外標法是最常用的高效液相定量方法,下面以外標法的不同進行分別討論。

 

2.1 單點外標法

 

在含量測定中,藥物的含量通常是在均勻且固定的(標示量),含量檢驗的規定區間通常也是圍繞標示量上下波動(如80%~120%)。因此,只要供試品濃度在線性范圍內并盡可能地靠近對照品濃度,采用單點外標法可以獲得更準確的判定結果,而進行線性擬合過程中有能引入更大的測定不確定度(參考文獻3)。

 

2.1.1 常規進樣方法

 

對于單點外標法而言,通常的進樣方式如下表1,特別是對于化藥來說:

 

表1 單點外標法的常規進樣方式

樣品

空白溶劑

系統適用性

對照品溶液

供試品溶液

質控對照品

重復份數

1

1

2

2

1

進針次數

1

1

5+2

各1

12h或每隔12針,結尾處

1) 對照品溶液第1份5針同時作為系統適用性的重復性,峰面積RSD應不大于2%。
2) 對照品溶液第2份計算回收率,回收率應在99.0~101.0%。
3) 計算含量以供試品溶液峰面積平均值除以對照品溶液第1份5針平均值。
4) 質控對照品作為保證色譜系統穩定性的指標,應間隔時間進行。
5) 對照品溶液第2份、供試品溶液2份結果之間的差異,應根據方法學驗證的結果,以相對偏差RD(如0.5%)或者相對標準偏差RSD(如2%)來控制。
 

此外,大家對于以上“對照品2份,5針+2針”的進樣方式存在一些替代方式,包括“對照品1份,6針”;“對照品2份,3針+2針”等。在有方法學驗證的基礎上是可以理解的,但系統適用性試驗作為分析方法不可或缺的一部分,可能受到監管機構越來越多的的挑戰(參考文獻4)。

 

2.1.2法規規定的生物藥進樣方法

 

在生物制品檢驗中,因為大分子藥物的高效液相表現不如小分子化藥,《中國藥典》2015年版等法規規定的進樣方法通常與以上常規的進樣方法有所區別,法規規定的生物藥進樣方法見表2。

 

通常是采用對照品溶液1份進3針,供試品溶液1份進3針,以供試品峰面積平均值除以對照品溶液峰面積平均值(如參考文獻5)。實際操作中,其系統適用性部分重復性指標大多以對照品和供試品的峰面積重復性代替,如對照品溶液3針、供試品溶液3針的峰面積RSD應不大于2%。

 

表2法規規定的生物藥進樣方法

樣品

空白溶劑

對照品溶液

供試品溶液

質控對照品

重復份數

1

1

1

1

進針次數

1

3

3

12h或每隔12針,結尾處

 

2.2 線性回歸法

 

對于同時測定濃度范圍比較大的藥品(特別是工藝步驟中濃度范圍更大),需要進至少5個非零的梯度對照品來進行線性回歸,再線性擬合得出供試品含量。其常規進樣方法與單點進樣法進樣方法也基本一致。

 

對于線性回歸法,比較適合的常規進樣方式如下表3,特別是對于分析時間短的藥物來說:

表3 線性回歸法的常規進樣方式

樣品

空白溶劑

系統適用性

對照品溶液

供試品溶液

質控對照品

重復份數

1

1

5濃度各2

2

1

進針次數

1

5

各1

各1

12h或每隔12針,結尾處

1) 以中間值對照品進樣5針計算系統適用性。
2) 線性回歸曲線的相關系數(r)通常應不低于0.99,5個濃度梯度對照品的反算回收率應進行控制(如90~108%等)。
3) 計算含量以供試品溶液峰面積平均值帶入線性回歸方程計算。
4) 質控對照品作為保證色譜系統穩定性的指標,應間隔時間進行,可以中間值對照品進樣計算回收率。
5) 不同濃度對照品溶液2份、供試品溶液2份結果之間的差異,應根據方法學驗證的結果,以相對偏差RD(如0.5%)或者相對標準偏差RSD(如2%)來控制。

 

2.3 法規規定的特殊進樣方法

 

在《中國藥典》2015年版等法規,還有1種特殊的進樣方法如3點線性回歸法。這種方法應該是融合可單點對照法和線性回歸法的優點。其特點在于在系統適用性通過后,對照品制備3個濃度,分別對應供試品標示量的不同范圍(如50%、100%、150%,范圍略大于或等于接受標準),回歸后求出供試品含量。根據方法和檢測器的不同,回歸方式也有區別:如《通則3120 人血液制品中糖及糖醇測定法》用的示差檢測器(RI)采用的是3點線性回歸法[6];而蒸發光散射檢測器(ELSD)等質量型檢測器采取的是3點對數線性回歸,浙江所應用蒸發光散射檢測器進行抗生素藥品質量分析也主要采用的是以上進樣方式。

 

簡單分析,感覺法規規定的特殊進樣方法就是對于這些不太穩定的方法或檢測器,采取的一種基于單點外標對照思維的折中方法,其進樣方式可參見表3。但由于比如RI、ELSD持續工作長時間下的不穩定情況,在檢驗任務大時,系統適用性通常不包括重復性指標,僅1份進1針;對照品溶液可以1份進1針;供試品溶液1份進1針。

 

三、小結與結論

 

1) 本文對現行法規和操作習慣下的高效液相檢驗時重復樣與進針次數進行了簡單的分析,對于不同檢驗藥品,有著不同的進樣方法。但以目前的趨勢來看,符合USP、ICH規定的系統適用性要求會在國內法規上越來越嚴,如何針對產品特點做出符合法規精神的高效液相方法是必須考慮的問題。

 

2) 對于高效液相,除了其特殊的系統適用性以外,其重復樣與進針次數核心精神還是參考法規對于鑒別、含量、雜質檢定時的基本要求,在方法學設計和驗證的時候要多考慮。盡可能以法規規定的方法做一個模板,這樣在面對檢查時解釋起來也比較好解釋。

 

3) 對于完全按標準進行的高效液相方法,其又可能存在著樣品過多,分析時間過長,高效液相排期緊張,系統穩定性逐漸變差,也只能大家群策群力,多多考慮了。

 

參考文獻:

1、梅希,藥物常規檢查項與方法學驗證測定/進樣針數討論,藥事縱橫,2017-08-29.

2、孫會敏, 田頌九. 高效液相色譜法簡介及其在藥品檢驗中的應用[J]. 齊魯藥事, 2011, 31(1): 38-42.

3、陳華, 王慧. 關于線性回歸法與單點外標法測量不確定度評估的初步探討[J]. 藥物分析雜志, 2008, 28(2):95-99.

4、李飛, 李云, 許真玉. 色譜系統適用性試驗在分析方法使用中的重要性[J]. 中國新藥雜志, 2019, 28(6):30-33.

5、2015年版《中國藥典》三部通則3124 重組人粒細胞刺激因子蛋白質含量測定法.

6、2015年版《中國藥典》三部通則3120 人血液制品中糖及糖醇測定法.

 

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來源:alamo藥事縱橫

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